Protein A/G 琼脂糖凝胶 产品使用说明





产品介绍
Protein A/G 琼脂糖凝胶 
使用说明书
 
一、产品简介

    Protein A/G琼脂糖凝胶为Protein A/G共价偶联到Sepharose琼脂糖介质(6%交联度)上形成的亲和纯化介质。Protein A/G 可与免疫球蛋白Fc段特异性结合,通过与免疫球蛋白的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG。 Protein A/G琼脂糖凝胶纯化介质可以对来自腹水、血清、细胞表达产生的IgG 进行纯化。介质使用后可以再生而不影响结合容量。另外,Protein A/G琼脂糖凝胶还可用于免疫沉淀实验,将一抗相对应的蛋白质从细胞粗提液中纯化出来。
 
二、性能参数

参数 指标
基质 Sepharose CL-6B (GE公司生产)
配基 Protein A/G
形状 球形
介质平均粒径 90 μm (45-165)
配基密度 ≈6mg Protein A/G/ml wet gel
动态载量 >30mg兔IgG/ml wet gel
>20mg人IgG/ml wet gel
最高流速(25℃) 450 cm/h (9ml/min)
推荐流速 <150 cm/h (3ml/min)
最高耐压 0.3 MPa (3 bar)
pH稳定性 3~10(长时间);2~11(短时间)
保存 4~8 oC(20%乙醇)
 
 
 
 
 
 
 
三、适用范围

     1、蛋白A和蛋白G对不同来源IgG的结合能力
 
IgG种类 蛋白A 蛋白G   IgG种类 蛋白A 蛋白G
猫IgG +++ +   人IgG3 - +++
鸡IgG - -   人IgG4 +++ +++
牛IgG + +++   人IgM + -
牛IgG1 + +++   猴IgG +++ +++
牛IgG2 +++ +++   猪IgG +++ ++
狗IgG +++ +   小鼠IgG ++ ++
山羊IgG + ++   小鼠IgG1 + ++
羊IgG1 + +++   小鼠IgG2a +++ ++
羊IgG2 +++ +++   小鼠IgG2b +++ +++
豚鼠IgG +++ +   小鼠IgG3 ++ +++
仓鼠IgG + ++   小鼠IgM - -
马IgG + +++   大鼠IgG + ++
人IgA + -   大鼠IgG1 - +
人IgA1 + -   大鼠IgG2a - +++
人IgA2 + -   大鼠IgG2b - +
人IgD - -   大鼠IgG2c ++ ++
人IgE ++ -   兔IgG +++ +++
人IgG +++ +++   绵羊IgG + ++
人IgG1 +++ +++   绵羊IgG1 + ++
人IgG2 +++ +++   绵羊IgG2 +++ +++
 
+++:强结合;++:中等结合;+:弱结合;-:不结合
 
  
2、分离纯化常用抗体的缓冲液条件
IgG种类 蛋白A结合能力 蛋白G结合能力 结合缓冲液pH值 洗脱缓冲液pH值
人IgG1 +++ +++ 6.0-7.0 3.5-4.5
人IgG2 +++ +++ 6.0-7.0 3.5-4.5
人IgG3 - +++ 8.0-9.0 ≤7.0
人IgG4 +++ +++ 7.0-8.0 3.0-6.0
小鼠IgG1 + ++ 8.0-9.0 4.5-6.0
小鼠IgG2a +++ ++ 7.0-8.0 3.5-5.5
小鼠IgG2b +++ +++ ≈7.0 3.0-4.0
+++:强结合;++:中等结合;+:弱结合;-:不结合
 

四、操作说明

1、缓冲液配制
A液:平衡(结合)缓冲液:1.5M甘氨酸缓冲液pH 9.0  
B液:洗脱缓冲液: 0.1M甘氨酸pH 3.0
C液:中和缓冲液:0.1M Tris-HCl缓冲液 pH 9.0
D液:再生缓冲液:0.1M甘氨酸pH 2.0
 
 
 2、操作步骤
       以1ml Protein A/G琼脂糖凝胶纯化介质为例,纯化操作包括装柱、平衡、进料、洗涤、洗脱和再生六步。
u          装柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上,封闭层析柱下端出口, 柱内注入纯水,排出层析柱内空气,先将垫片完全浸没于水面下方,在保持水平的状态下,小心推向底部,避免垫片下方滞留气泡;
2) 打开层析柱下端出口,排出柱中纯水;在液面低至距垫片1~1.5cm 高度时封闭下端出口,用移液管吸取介质,将介质加入到层析柱中;让介质自然沉降,不应存在气泡,如有气泡必须重新装柱;
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免垫片与介质接触面滞留气泡;
4)     用一段时间后,如果层析柱流速减慢,可先用小镊子沿边缘将垫片推翻,夹出垫片,倒出介质,清洗或更换新的垫片,按2)、3)所述步骤重新装柱;或不更换垫片,用细棒搅拌介质,使其疏松,再装入上端垫片。
u          平衡:用10-20倍体积的平衡缓冲液平衡层析柱,直至流出
  液吸光值不变。
u  加样:样品采用平衡缓冲液稀释,调节其pH值与平衡缓冲液相同。加样时流出液吸光值在10-20min内保持不变,可认为加样完毕,停止加样。
注:流速不宜过快,对于1ml介质,流速保持在0.5ml/min为宜。
u          洗涤: 加样完毕后用平衡缓冲液洗涤至基线。
u  洗脱:用洗脱缓冲液洗脱,收集流出液,并用中和缓冲液中和至中性,避免抗体失活。
u  介质保存:用5~10倍介质体积平衡缓冲液,重新平衡介质,最后加入20%乙醇,置4 ℃条件下保存。


五、使用实例

益肽Protein A/G琼脂糖凝胶纯化辛酸-硫酸铵沉淀后的兔血清
纯化介质:金益肽TM Protein A/G琼脂糖凝胶  1ml;
样品:辛酸-硫酸铵沉淀后的兔血清
A液:平衡(结合)缓冲液:1.5M甘氨酸缓冲液pH 9.0 
  B液:洗脱缓冲液:0.1M甘氨酸pH 3.0
  C液:中和缓冲液:0.1M Tris-HCl缓冲液 pH 9.0
 
 
 
 
图1:金益肽Protein A琼脂糖凝胶(图A)和Protein G琼脂糖凝胶(图B)纯化兔IgG效果图



         1、 Marker   2、上样液    3、流穿液   4、洗脱液

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